Lección sobre Bacterias Patógenas de Plantas

(Dedicada a los alumnos del Máster de Patogénesis Bacteriana)

Las bacterias son uno de los agentes biológicos causantes de enfermedades en las plantas. A pesar de la gran cantidad de interacciones que tienen las plantas con las bacterias podemos constatar que el desarrollo de enfermedades es más la excepción que la norma general. Otros agentes causantes de estrés biótico son hongos, virus, nemátodos, insectos herbívoros, y otras plantas. Sin embargo, a veces no son seres vivos los que acorralan a las plantas, y son la causa de estrés, enfermedades y muerte. Las plantas también pueden ser agredidas por factores abióticos como sequía, frío, salinidad, falta de oxígeno, daño mecánico o contaminación con metales pesados. Las plantas disponen de sistemas complejos, a veces muy especializados, y que a veces se solapan entre sí, para responder y defenderse de todas las agresiones que he mencionado.

Desde el punto de vista agrícola, los principales agentes causantes de enfermedades en las plantas son hongos y virus, si tenemos en cuenta las pérdidas económicas a que dan lugar. No obstante, en determinados ambientes algunas de las enfermedades producidas por bacterias también son muy relevantes.

Tipos de bacterias según la relación que mantienen con las plantas

... porque no todas las bacterias que se relacionan con las plantas están cargadas de malas intenciones.

1.- Bacterias que viven en estrecha relación con las plantas y provocan enfermedades en éstas. Por ello, las consecuencias de esta relación son negativas para la planta. Es el caso de las bacterias patógenas como por ejemplo Pseudomonas, Agrobacterium , Erwinia, Ralstonia, etc... que son de las que vamos a hablar en esta lección.

2.- Bacterias que viviendo en estrecha relación con las plantas permiten una asociación que es beneficiosa tanto para la planta como para la bacteria. Esta interacción mutualista es positiva para la planta. Es el caso de bacterias no patógenas como Azorhizobium, Bradyrhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium, etc...

Estos dos tipos de interacciones planta-bacteria se alcanzan gracias a la existencia de una señalización molecular finamente regulada entre las bacterias y las plantas. Sin embargo, cada vez es más difusa la frontera entre una interacción mutualista y otra patogénica, ya que tanto los procesos de reconocimiento como las rutas de transducción de señales, que finalmente llevan a la respuesta de la planta, son muy parecidos en ambos tipos de interacción.

3.- Todavía queda un tercer tipo de interacción que numerosos géneros de bacterias establecen con las plantas, y que podría ser definido como neutral ya que no existe un efecto claramente positivo o negativo para la planta y, por tanto, no entran dentro de los grupos anteriores. Éste es el caso de bacterias como Bacillus, otras Pseudomonas, Serratia, etc... No obstante, cada vez hay más autores que describen a estas bacterias como claramente beneficiosas para las plantas ya que, de alguna manera, favorecen el crecimiento de la planta o la protegen contra un amplio rango de patógenos vegetales. Muchas de las bacterias que viven en la rizosfera son capaces de proveer de nutrientes, microelementos, hormonas, y otras moléculas importantes a las plantas. Algunas de ellas viven en la superficie de las plantas, es decir, son epifitas, y otras viven dentro de las plantas entre sus células y, por tanto, son endofitas. Otras producen antibióticos, sideróforos o captadores del escaso hierro del entorno. Algunas incluso pueden inducir resistencia sistémica poniendo a tejidos alejados en guardia ante el posible ataque de un patógeno. El origen de su comportamiento puede estar en las señales de comunicación celular entre los miembros de la misma especie.

Las bacterias se comunican por medio de señales químicas. Todos los miembros de una especie determinada secretan al medio unas moléculas que todas ellas reconocen. Si la densidad poblacional de bacterias es muy alta entonces todas detectarán gran número de moléculas en el medio y las propias bacterias "tendrán conciencia" de que ya son muchas bacterias en el medio, con lo que pueden llevar a cabo procesos en los que sea ventajoso ser muchas, como por ejemplo atacar a una planta hospedadora, y dejar para mejor ocasión aquellos procesos en los que ser muchas sea un inconveniente. A este sistema de comunicación entre las bacterias se le denomina "quorum sensing".

Definición de bacteria patógena de plantas (fitopatógena)

Se define como tal a la bacteria que tiene capacidad para producir una enfermedad en la planta. No todas las bacterias patógenas de plantas producen enfermedades en todas las especies de plantas. Lo normal es que cada bacteria patógena tenga una o varias especies vegetales a las que ataca y enferma. Esta o estas especies de plantas se denominan hospedadores o "hosts" de esa bacteria en particular. Cuando ninguna de las cepas conocidas de un tipo concreto de bacteria es capaz de producir una enfermedad en una especie vegetal decimos que esa especie de planta no es un hospedador de la bacteria o, dicho de otro modo, es un "non host". La investigación actual para desentrañar los mecanismos por medio de los cuales algunas especies son "non host" de los patógenos de plantas tiene una gran importancia. Este tipo de resistencia vegetal es muy estable en campo y los mejoradores de la resistencia de las plantas de cultivo a las enfermedades ven en ella el futuro para conseguir variedades más resistentes.

La patogenicidad no debe ser confundida con la virulencia. La virulencia es la capacidad que tiene una bacteria patógena para incrementar la severidad de la enfermedad en la planta. Lo normal es que las bacterias patógenas, en cuanto entran en contacto con la planta, traten de poner en marcha todos los mecanismos que estén a su alcance (factores de virulencia) para invadir y colonizar rápidamente el tejido vegetal. Así las bacterias conseguirán alcanzar elevados niveles de población antes de que la respuesta de la planta limite el crecimiento bacteriano.

¿Cuándo se descubrió la primera bacteria fitopatógena?

Sólo han pasado poco más de cien años desde que una bacteria fue implicada como agente causal de una enfermedad vegetal. En 1878 se demostró qe las bacterias estaban asociadas con un tipo de tizón abrasivo en perales y manzanos de Illinois y Nueva York (EEUU). La enfermedad causada por Erwinia amylovora, ahora dispersa por muchas de las zonas templadas del mundo, sigue siendo un factor limitante para el cultivo saludable de perales, manzanos, y otras rosáceas (familia de plantas a la que pertenecen perales y manzanos). En 1885, J.C. Arthur aisló una bacteria de plantas enfermas, la cultivó y después la inoculó al mismo hospedador para reproducir la enfermedad que ocurría de forma natural. A continuación la recuperó de los tejidos enfermos y, de este modo, completó lo que se conoce como postulados de Koch.

En un campo con un ataque severo de esta primera enfermedad catalogada como bacteriana, se puede observar cómo se van secando progresivamente todos los brotes jóvenes, la parte superior de las plantas va adquiriendo color marrón, e incluso puede que las plantas terminen muriendo porque las bacterias, como patógenos vegetales, pueden causar enfermedades graves y de peores consecuencias económicas en los cultivos.

Sintomatología de las enfermedades bacterianas

Además de este tipo de síntomas de marchitamiento generalizado y más o menos intenso, los síntomas que se pueden observar en las enfermedades bacterianas son muy diversos: manchas, mosaicos, pústulas, costras, en hojas, tallos y frutos, podredumbres, sobretodo en tubérculos, algunas muy malolientes, e incluso la muerte, como he dicho antes. A veces se producen distorsiones en hojas, tallos y flores, lo que suele estar relacionado con un desbalance hormonal en la planta causado por la bacteria, o proliferaciones celulares de tipo tumoral en la parte basal del tallo de las plantas o en sus raíces.

¿Qué forma tienen las bacterias patógenas de plantas?

Las bacterias asociadas con plantas tienen morfología variada. Hay formas alargadas o bastones (bacilos), esféricas (cocos), formas irregulares o bastones pleomórficos, y formas espiraladas. No obstante, la mayoría de las bacterias asociadas con las plantas son bastones y, en general, constituyen un grupo muy heterogéneo. Algunas bacterias fitopatógenas están relacionadas con patógenos de animales y humanos.

Las bacterias patógenas de plantas pueden tener o no apéndices, tanto flagelos localizados normalmente en los polos de las células, como fimbrias o pili, unos apéndices más pequeños y con forma de hilo que se distribuyen por la mayor parte de la superficie celular. Los flagelos intervienen mayoritariamente en el movimiento de la bacteria y las fimbrias están más implicadas en la adherencia. Aunque hay evidencias de que las células flageladas producen lesiones mayores que los mutantes no flagelados, lo cierto es que las bacterias que no tienen apéndices detectables también pueden ser patógenos efectivos.

Condiciones de crecimento de las bacterias patógenas de plantas

Cuando estas bacterias se cultivan en el laboratorio lo normal es que tengan un buen crecimiento a temperaturas óptimas de 20 a 30ºC. Sólo hay unas pocas bacterias que crecen a 37ºC como los patógenos de animales. Este es el caso de Burkholderia cepacia, especie de la que algunas cepas pueden infectar a humanos inmunodeprimidos. La mayor parte de las bacterias fitopatógenas son aeróbicas, algunas son anaerobias facultativas y muy pocas son anaeróbicas. Algunas bacterias, cuando alcanzan un elevado nivel poblacional, generan pigmentos observables en la propia colonia o en el medio de cultivo. Otras dan lugar a compuestos volátiles característicos, a veces de olor desagradable. En cuanto a las necesidades nutritivas de las bacterias patógenas de plantas hemos de reconocer que son muy variables, el medio va de simple a complejo, algunas tienen necesidades muy particulares o sofisticadas, y otras ni siquiera se pueden cultivar. Este es el caso de las bacterias "fastidiosas" que colonizan el tejido vascular. Poco a poco, a medida que vamos sabiendo más de sus necesidades, podemos llegar a cultivar algunas de ellas en un medio artificial.

Tratamiento de las plantas afectadas

En algún caso muy particular, como ocurriría con algún árbol simbólico o propio de un museo, se pueden usar antibióticos para combatir a las bacterias. Ya se conoce la eficacia de éstos en algún caso. Pero, en general, a nivel práctico lo habitual es no hacer ningún tratamiento ni en los cultivos ni en las plantas ornamentales por los problemas que ocasionan los antibióticos de contaminación medioambiental y generación de cepas resitentes a los mismos. Por supuesto que también resultaría prohibitivo desde el punto de vista económico. Por ello, las únicas medidas eficaces que se toman son preventivas:

* Uso de semillas y plantas sanas, así como variedades resistentes.

* Buenas prácticas de cultivo que aseguren una buena nutrición, de modo que las plantas estén fuertes.

* Evitar las heridas debidas a poda, rotura de ramas, grietas por frío, producidas por insectos, etc..., ya que son la principal puerta de entrada de las bacterias en los tejidos vegetales. El Oxicloruro de cobre sirve para proteger las heridas de las infecciones.

* Recortar y eliminar tallos y hojas afectados.

¿Cómo se clasifican taxonómicamente las bacterias fitopatógenas?

Desde que se generalizó la secuenciación, las bacterias han dejado de clasificarse por criterios bioquímicos, de necesidades de nutrientes, de comportamiento, etc... Actualmente se alinean secuencias de ADN o de ARN y se determina cuán parecidas son de forma rápida y precisa. Para ello se busca una secuencia que esté muy conservada en los genomas, generalmente el ARN ribosómico 16S (que junto con proteínas constituye la subunidad menor 30S de los ribosomas de procariotas), y se compara. Este método de clasificación es bastante bueno, pero aún existe uno mejor, que está siendo propiciado gracias a la existencia de proyectos de secuenciación masiva de genomas bacterianos. En este caso, y gracias a la genómica comparativa, se observa cómo de parecidos son los genomas de los distintos microorganismos. La bondad del método reside en que ya no se apoya en una sola secuencia, muy conservada, eso sí, pero sólo una al fin y al cabo, sino en todo el genoma.

Los genomas bacterianos suelen constar de un cromosoma circular de DNA de doble hebra y de uno o varios plásmidos, de menor tamaño en general. Habitualmente los genes que codifican los factores de virulencia se localizan en agrupaciones aisladas dentro de cromosoma o, más frecuentemente, de alguno de los plásmidos, que se denominan islas de patogenicidad. Estas islas, muchas veces flanqueadas por secuencias repetidas de ADN o de elementos transponibles, pueden heredarse por transferencia horizontal. Pues bien, gracias a la genómica comparativa hemos sabido que la mayoría de los genes de virulencia son extrañamente compartidos por todas las bacterias, cualquiera que sea su grupo taxonómico y por muchos años que las separen evolutivamente. Esto indica que la mayoría de las bacterias se han hecho patógenas con el tiempo. No hay que olvidar que los hospedadores, en este caso las plantas, aparecieron sobre la tierra muchos miles de años después que las bacterias, por lo que es lógico pensar que antes las bacterias no estaban "armadas" para atacarlas. Fueron adquiriendo las armas poco a poco y se las fueron transfiriendo entre ellas, y así pudieron llegar los genes de virulencia a bacterias que no estaban emparentadas en absoluto porque evolutivamente estaban separadas por muchos muchos años. Lógicamente, todas estas bacterias estaban expuestas al mismo ambiente antimicrobiano (las plantas también evolucionaron para defenderse) y, por tanto, a la misma presión selectiva. La evolución hacia cepas más virulentas precisaba de reorganizaciones genómicas y de presión selectiva.

Pero la clasificación de las bacterias fitopatógenas no se hace por los genes de virulencia, ya vemos que muchos son compartidos por bacterias poco emparentadas, sino por esa parte del genoma que fue evolucionando a lo largo del tiempo y que mantiene el registro de los miles de años de evolución. Según ello, nos encontramos con dos grandes grupos de bacterias: Gram-positivas y Gram-negativas. Su nombre se debe a la diferente coloración que adquieren con la tinción de Gram, azulada las Gram-positivas, y roja las Gram-negativas. Pero ya sabemos que esta diferencia también se correlaciona con una diferencia genética y, por la importancia que tiene para combatirlas, con una diferencia estructural importante. Esta diferencia radica en la envuelta celular. Las bacterias Gram-positivas, en general, tienen por encima de la membrana plasmática una gruesa envuelta de peptidoglicano (usamos algunos antibióticos como la lisozima para interferir en su síntesis). En cambio, las Gram-negativas tienen una envuelta de peptidoglicano mucho más fina y, por encima de ella, una especie de segunda bicapa lipídica. La capa de lípidos más externa está unida a cadenas de azúcares y constituye el LPS o lipopolisacárido, uno de los principales elementos antigénicos de las bacterias Gram-negativas. Evolutivamente, sabemos que las bacterias Gram-positivas son los antepasados de las Gram-negativas. No obstante, las bacterias Gram-positivas no constituyen un grupo homogéneo, sino que se dividen en dos grupos muy divergentes. Por un lado están las Actinobacterias en las que su ADN se caracteriza por contener una proporción elevada de G+C, y los Firmicutes, con un ADN que contiene una baja proporción de G+C. Actinobacterias y Firmicutes divergieron muy tempranamente en la historia evolutiva. Dentro de los Firmicutes existe un grupo especial de bacterias, denominados Mollicutes, que carece de envueltas externas por encima de la membrana plasmática. Dado que la envuelta externa o pared celular de las bacterias es la que dota de rigidez y resistencia a las bacterias, y les da su forma característica, los Mollicutes, al carecer de ella adquieren formas variadas o pleomórficas. Etimológicamente, Molli significa "blando, maleable", y cute "piel". Además, suelen vivir en el interior del hospedador que es un ambiente donde se encuentran más protegidos. Esta carencia de pared celular y su menor tamaño fueron las razones por las que, antiguamente, se pensaba que eran organismos más primitivos que las bacterias Gram-positivas. Hoy en día sabemos que, en realidad, son simplemente organismos mucho más especializados, que se han adaptado a la vida dentro del hospedador y, debido a ello, han perdido la envuelta celular.

En todos los grupos de bacterias mencionados no sólo hay fitopatógenos, también aparecen patógenos de animales y humanos, y también bacterias que no son patógenas para nadie, que simplemente viven como saprófitos en distintos medios, o que incluso desarrollan una labor que es beneficiosa para otros seres vivos.

Bacterias fitopatógenas Gram-positivas

Lo que sabemos de las bacterias fitopatógenas no se reparte por igual entre las Gram-negativas y Gram-positivas. De hecho, los avances en la comprensión de la fitopatogenicidad están casi completamente restringidos a los organismos Gram-negativos. Las razones principales de ello son que resultan más sencillos de manejar y que disponemos de numerosas herramientas genéticas que nos facilitan la vida a los investigadores. Dicho hecho, no obstante, lo cierto es que las bacterias fitopatógenas son en su mayor parte Gram-negativas. Sin embargo, de los pocos fitopatógenos Gram-positivos que se conocen, algunos son bastante importantes por las enormes pérdidas que ocasionan en las plantas de cultivo. Así que vamos a hacer un breve recorrido por los principales fitopatógenos Gram-positivos.

Las bacterias Gram-positivas utilizan gran variedad de estrategias para invadir las plantas del hospedador. Entre ellas se encuentra la producción de fitotoxinas para facilitar su replicación intra e intercelular, la producción de citotoxinas para generar vesículas de invasión en los tejidos, la secreción de proteínas para desarrollar a modo de úlceras, y la utilización y manipulación de insectos que se nutren de la savia de las plantas para introducirse en las células del floema o del xilema. El análisis funcional de los genes de virulencia de Actinobacterias y Firmicutes está revelando cómo estos antiguos organismos procarióticos manipulan los procesos metabólicos de la planta y, a veces, de los insectos, en su propio beneficio.

Rhodococcus fascians

Es el agente causante de una enfermedad conocida como fasciación del tallo y que consiste en la aparición de una serie de agallas o vesículas de tejido frondoso en el tallo de una amplio rango de hospedadores. La enfermedad se debe a la aparición de masas de yemas de tallo que no llegan a desarrollarse. Los genes de virulencia de este fitopatógeno se encuentran agrupados en un operón conocido como fas. Entre los genes de este operón se encuentran los que codifican las proteínas ncesarias para la síntesis de una hormona vegetal (citoquinina) modificada, que resulta imprescincible para la virulencia del patógeno. De este modo Rhodococcus fascians provoca un desbalance de hormonas en la planta, principalmente de auxina y citoquinina, las hormonas del desarrollo. El efecto producido en la planta es el inicio de la división de los tejidos corticales y con ello del desarrollo de los meristemos durmientes y la aparición de otros de novo.

Rhodococcus fascians lleva a cabo una colonización inicialmente epifítica. Las formas endofíticas se encuentran en los espacios intercelulares y, a veces, dentro de las células de la planta.

Streptomyces scabies

Agente causante de una enfermedad conocida como costra de la patata (Solanum tuberosum). Su rango de hospedadores es bastante amplio e importante por afectar a tubérculos y raíces de cultivos de gran importancia económica. Además de la patata, son hospedadores de esta especie bacteriana la remolacha (Beta vulgaris), la zanahoria (Daucus carota), la chirivía (Pastinaca sativa), el rábano (Raphanus sativus), el colinabo (Brassica napobrassica), y el nabo (Brassica rapa). El género Streptomyces tiene tendencia al crecimiento micelial, como si fuera un hongo. Numerosas especies de este género son microorganismos saprófitos del suelo. De hecho, son la principal fuente de obtención de antibióticos. No obstante, unas pocas especies han adquirido la capacidad para infectar los tejidos subterráneos de las plantas.

Los síntomas de la enfermedad aparecen como sombras distribuidas de forma aleatoria que forman lesiones parecidas a un bajo-relieve con aspecto de corcho. El tamaño y el color de las lesiones es variable, aunque típicamente son marrones con un diámetro de pocos milímetros. La costra común es una enfermedad severa que se distribuye por todo el mundo y que, al menos en el caso de la patata, se encuentra en franca expansión. La enfermedad no afecta al interior de la patata, pero afecta a su aspecto y, por tanto, al valor económico de la cosecha. Lo normal es que todos los síntomas se observen en la parte subterránea de la planta, de modo que la parte aérea de la planta aparece perfectamente saludable. Sólo cuando las plantas son muy pequeñas (estado de plántula) Streptomyces scabies es capaz de inhibir su crecimiento, tanto en el caso de monocotiledóneas como en el de las dicotiledóneas.

La mayoría de los agentes causantes de costra producen unas fitotoxinas llamadas taxtominas que son los factores esenciales de su virulencia. Los genes implicados en la síntesis de taxtomina están agrupados en una isla de patogenicidad que puede ser transferida horizontalmente a especies próximas no patógenas. En la mayor parte de especies patógenas de Streptomyces la taxtomina A es la forma predominante de fitotoxina encontrada y también es la toxina mejor caracterizada de todas las que producen los fitopatógenos Gram-positivos. La molécula de taxtomina A es un dipéptido nitrado formado a partir de NO. Aunque la síntesis de taxtomina A es compleja y aún está en estudio, parece que la celobiosa producida por la planta es el inductor de su síntesis a nivel genético. En cambio, otras moléculas, entre las que se encuentran aminoácidos aromáticos como el triptófano y algunos metabolitos secundarios, actúan como inhibidores de la producción de la toxina.

Leifsonia xyli

Leifsonia xyli subsp. xyli, junto con otros patógenos de plantas como la Gram-negativa Xylella fastidiosa (ver más adelante), pertenece a un único grupo de bacterias fastidiosas limitadas a los vasos del xilema de las plantas. Es el agente causal de la enfermedad del raquitismo de los retoños, la principal enfermedad de la caña de azúcar en todo el mundo.

El genoma de Leifsonia xyli subsp. xyli tiene el honor de corresponder al primer genoma de una Actinobacteria secuenciado. Este genoma se caracteriza por una elevada presencia de pseudogenes y por su reducido tamaño. Esto último seguramente es debido a la restricción de su nicho ecológico al xilema de la caña de azúcar. Algunos de los presuntos elementos transferibles se encuentran en el mencionado patógeno vegetal limitado al xilema, Xylella fastidiosa, lo que tiene se lógica si ambas ocupan el mismo nicho ecológico. En las regiones transferibles se encuentran los genes que codifican enzimas de degradación de la pectina y celulosa de las paredes celulares como pectinasas, galacturonasas y celulasa. Esta degradación da como resultado la maceración de los tejidos del hospedador. También tiene un gen codificante de una proteína miembro de la familia de las desaturasas de ácidos grasos y que podría redirigir la ruta de biosíntesis de los carotenoides a la biosíntesis de ABA en la bacteria. El ABA o ácido abscísico es una hormona vegetal implicada en la inhibición del crecimiento de los tejidos vegetales. De este modo la producción y secrección de ABA puede estar contribuyendo al fenotipo de raquitismo que se observa en las plantas infectadas.

Clavibacter michiganensis

Esta especie se subdivide en 5 subespecies de acuerdo con sus distintos hospedadores, todas ellas colonizadoras del xilema. C. michiganensis subsp. sepedonicus es el causante de la podredumbre anular de la patata (Solanum tuberosum), C. michiganensis subsp. nebraskensis provoca el tizón en el maíz (Zea mays), C. michiganensis subsp. teselarius produce la aparición de manchitas en las hojas de trigo (Triticum aestivum), y C. michiganensis subsp. insidiosus produce el marchitamiento y raquitismo de la alfalfa (Medicago sativa).

Por su parte C. michiganensis subsp. michiganensis causa el marchitamiento y la úlcera del tallo de tomate (Solanum lycopersicum), una de las más importantes enfermedades bacterianas del tomate en todo el mundo. Los síntomas de esta enfermedad se pueden observar en los distintos órganos de la planta: Por un lado, el marchitamiento unilateral de las hojas es el primer síntoma de la enfermedad. Más tarde la marchitez se extiende a todas las hojas. En el tallo aparecen unas lesiones en forma de úlceras. La planta se marchita del todo y muere. En el caso de que la infección se haya producido en el último estadío de desarrollo de la planta de tomate, las plantas pueden sobrevivir para fructificar, pero en tal caso en los frutos aparecerán unas manchas denominadas ojos de pájaro, y a menudo la semilla terminará infectándose y constituyéndose en inóculo de una nueva infección. En los suelos contaminados con C. michiganensis subsp. michiganensis, la bacteria puede entrar a través de heridas en el tallo o en la raíz, y se dirige al xilema. El xilema permite la colonización sistémica de la planta por la bacteria. Precisamente, el marchitamiento se debe en gran medida al atasco de los vasos del xilema a consecuencia de la síntesis de polisacáridos extracelulares (EPS) y a la destrucción de los mismos por la presencia de enzimas que los degradan como celulasa, poligalacturonasa, pectín metil esterasa y xilanasa.

Phytoplasma

Estos Firmicutes fastidiosos están básicamente restringidos a las células del floema y, por ahora, no hemos sido capaces de hacerlos crecer en medios artificiales, probablemente porque necesitan algún componente muy específico que limita su crecimiento y que sí está presente en el floema de las plantas hospedadoras. No penetran por sus propios medios dentro de las plantas hospedadoras, sino que usan un medio de transporte externo, insectos que se nutren del floema de las plantas, cicadélidos en su mayoría, a los que también pueden ocasionar daños. Cuando los insectos introducen su estilete dentro de floema de la planta captan los Phytoplasma que pasan a su tracto digestivo donde proliferan, a continuación atraviesan la pared del mismo y usando la hemolinfa como medio de transporte pasan a las glándulas salivares. Cuando el insecto va a nutrirse a una nueva planta, deposita en ella los Phytoplasma como inóculo de una nueva infección. El proceso completo de transmisión puede durar de 2 a 4 semanas en función de la concentración de la fuente y de la duración del período de adquisición en la planta afectada.

Dos son los tipos de síntomas a que dan lugar típicamente los Phytoplasmas: a) Amarilleamiento de los tejidos aéreos debido a la disfunción del floema, y posiblemente también por la competencia entre el patógeno y el hospedador vegetal por los fotosintatos que lleva el floema. Debido a lo anterior se produce marchitamiento, raquitismo (acortamiento de entrenudos), clorosis foliar, amarilleo de hojas, necrosis del floema y colapso de las células acompañantes, deposición de callosa en los elementos del floema, y finalmente muerte de la planta. Estos son los síntomas que se pueden observar en las palmeras (Cocos nucifera). En las últimas cuatro décadas esta enfermedad ha ocasionado pérdidas enormes en Florida y Jamaica. b) Alteraciones en el balance hormonal de reguladores del crecimiento de la planta, lo que da lugar a deformaciones y crecimientos excesivos de ciertos órganos. En este grupo de síntomas se incluyen las proliferaciones de vástagos axilares (originándose las llamadas escobas de bruja) crecimiento de la parte superior en forma de ramo, venas hinchadas, flores que pueden ser parcial o completamente estériles, que pueden exhibir filodia (pétalos que asumen la forma de hoja), asimetría, verdeo de los pétalos o distribución irregular del pigmento de los pétalos. En algún caso, como ocurre con las Poinsettias variegadas, este síntoma se considera una cualidad positiva.

Spiroplasma citri

Este grupo de Mollicutes fastidiosos se parece mucho al de los Phytoplasma, con el que está emparentado, presenta una importante diferencia con él, no obstante. Los Spiroplasma sí se pueden cultivar en un medio artificial (al menos los conocidos) aunque tienen requerimientos nutricionales particulares, como esteroles y otros ingredientes inususales que, al final, también complican un poco su cultivo. Al igual que los Phytoplasma, se transmiten por insectos de la familia de los cicadélidos que se nutren del floema de las plantas.

Los síntomas que presentan las plantas afectadas por los distintos Spiroplasma son muy similares a los del amarilleamiento que causan los Phytoplasma. Entre ellos destacamos el raquitismo por colapso de los tubos cribosos y deposición de callosa, así como la clorosis y marchitamiento de las partes verdes de la planta. En el caso concreto de Spiroplasma citri, el desarrollo de síntomas está relacionado con el desbalance que los fitopatógenos provocan en el metabolismo de carbohidratos que da lugar a concentraciones de glucosa anormalmente altas en el floema. Esto da como resultado la clorosis y el característico acortamiento de los entrenudos. No poseen sistemas fosfotransferasa de azúcares pero sí numerosos transportadores activos que llevan a cabo la captación de diversos azúcares. Además generan proteínas de virulencia que pueden pasar de una célula del floema a otra en los tejidos en desarrollo a través de los plasmodesmos. Por ello los síntomas se observan mayoritariamente en tejidos en desarrollo. En cítricos, Spiroplasma citri hace que los árboles afectados tengan un crecimiento reducido, las hojas sean más pequeñas y los frutos amargos y asimétricos. Este mismo Spiroplasma fue encontrado también en plantas de rábano picante que presentaban raíces debilitadas, atrofiadas y frágiles, y necrosis del floema. En maíz se descubrió en los años 70 a Spiroplasma kunkelii en plantas de aspecto achaparrado.

Bacterias fitopatógenas Gram-negativas

Como ya he señalado anteriormente, éste es el grupo de fitopatógenos más importante desde el punto de vista de los daños que produce, y también es el grupo más estudiado y, en consecuencia, el que más ha influido en el conocimiento que tenemos actualmente de la patogénesis bacteriana. Dentro del superreino Bacteria, la mayor parte de los fitopatógenos pertenecen al phylum de las Proteobacteria. Dentro de este grupo existen tres clases que los engloban: alfa, beta, y gamma-Proteobacteria. Por el número de fitopatógenos y por su gran importancia destacamos en primer lugar a la clase de las gamma-Proteobacteria. A esta clase pertenecen tres familias muy importantes dentro de los fitopatógenos: Pseudomonadáceas, Enterobacteriáceas, y Xanthomonadáceas. En la clase de las alfa-Proteobacteria se encuentra la familia de las Rizobiáceas que incluye tanto a fitopatógenos como Agrobacterium como a bacterias que mantienen una relación de mutualismo con las leguminosas y que, por tanto, son bacterias amigas de las plantas (géneros Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, etc...). Y dentro de la clase de las beta-Proteobacteria destacamos por sus peculiaridades a la familia Burkholderiáceas.

Iniciamos nuestro breve recorrido por los más importantes fitopatógenos Gram-negativos empezando por la bacteria patógena de plantas más conocida, Pseudomonas syringae, y miembro destacado de la familia Pseudomonáceas en el phylum de las gamma-Proteobacteria. En esta especie vamos a profundizar en los distintos aspectos de la patogénesis, muchos de los cuales son comunes a otros fitopatógenos y, en la medida de lo posible, nos centraremos en un patosistema particular, el que forma Pseudomonas syringae con la planta modelo Arabidopsis thaliana.

Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae es una bacteria Gram-negativa patógena de plantas de la que se conocen numerosas cepas que se caracterizan por sus diversas interacciones con plantas de especies diferentes. Las cepas específicas se asignan a uno de los 50 patovares conocidos según su capacidad de infectar a las distintas especies de plantas. Los distintos patovares de P. syringae varían en su capacidad de supervivencia epifítica, en la naturaleza de los síntomas que provocan, y en su rango de hospedadores. La base molecular de todas estas interacciones es compleja ya que depende de numerosos factores que se solapan entre sí. Entre los factores de virulencia más importantes encontramos fitotoxinas, fitohormonas, adhesinas, enzimas que degradan la pared, y, lo más importante, proteínas efectoras que se translocan al interior de plantas mediante sistemas de secreción de tipo III. Algunas cepas tienen genes codificantes de proteínas nucleadoras de hielo de la membrana externa. Estas cepas pueden causar daños por congelación a las plantas a temperaturas ambientales superiores a la de congelación. Son las denominadas cepas Ice+.

Existe una base de datos muy importante sobre este fitopatógeno donde se pueden encontrar todas las secuencias que se encuentran en las bases de datos públicas de todos los patovares de P. syringae. Tres cepas tienen su genoma completamente secuenciado, una de ellas tiene como plantas hospedadoras a tomate y a Arabidopsis (patovar tomato DC3000), y las otras dos tienen como planta hospedadora a judía (patovar syringae BT28a y patovar phaseolicola 1448A). No obstante, la era genómica para todas las bacterias patógenas de plantas comenzó oficialmente en el año 2000 con la publicación de la secuencia de Xylella fastidiosa, otra gamma-Proteobacteria de la familia Xanthomonadáceas, y causante de la clorosis variegada de los cítricos.

A pesar de que las tres cepas de P. syringae comparten el nombre de especie, sin embargo son casi tan diferentes como Escherichia coli y Slamonella typhimurium, dos enterobacteriáceas. La realidad es que los fitopatógenos con el mismo nombre a veces no son tan parecidos y, en el caso de las tres cepas de P. syringae, parece que la cuarta parte del genoma no se encuentra compartido entre las cepas. En el caso particular de la Xanthomonadácea Xanthomonas campestris pv. campestris, se conocen dos cepas con diferente rango de hospedadores y sólo el 13% del genoma no es compartido. Muchos de los genes que no están compartidos tienen un papel en la especificidad del hospedador.

La cepa DC3000 de P. syringae pv. tomato fue la que primero se secuenció de las tres con la secuencia completada. Esta cepa es un derivado espontáneo resistente al antibiótico Rifampicina de la cepa natural DC52. El genoma de esta cepa fue publicado en 2003. Mide 6,5 Megabases y consta de un cromosoma circular y dos plásmidos que en conjunto codifican 5.763 posibles secuencias codificantes (ORFs de "open reading frame"). En él se han identificado 298 genes de virulencia entre conocidos y predichos (lo que supone en total el 5% del genoma) que engloban varias agrupaciones de genes codificantes de 50 proteínas efectoras de tipo III (31 de ellas están confirmadas y 19 son predicciones). El genoma de P. syringae presenta numerosos transportadores necesarios para la adquisición de nutrientes, particularmente azúcares, así como genes implicados en la adhesión a la superficie vegetal. Más del 12% de los genes codifican proteínas factores de transcripción. Esta enorme inversión en regulación puede reflejar la necesidad de una rápida adaptación a los diversos ambientes que van desde el crecimiento epifítico a la patogénesis. Gracias a la genómica comparativa sabemos que el genoma de P. syringae tiene un gran parecido con otras dos pseudomonáceas secuenciadas, P. putida y P. aeruginosa, si bien más de 1000 genes son únicos en la cepa DC3000 de P. syringae pv. tomato, 800 de los cuales carecen de función conocida.

La sintomatología de la enfermedad causada por P. syringae pv. tomato DC3000 es bien concocida. Consiste en una serie de manchitas observables tanto en los frutos como en las hojas, en el caso concreto de tomate.

Nosotros nos vamos a centrar en la interacción entre P. syringae pv tomato DC3000 y la planta Arabidopsis thaliana. Denominamos patosistema al conjunto de elementos que forman parte de esta interacción, el fitopatógeno P. syringae, la planta hospedadora Arabidosis thaliana, y el conjunto de factores medioambientales que los rodean. ¿Por qué preferimos estudiar este patosistema en lugar del formado por P. syringae y tomate? Pues porque Arabidopsis presenta algunas ventajas respecto al tomate en la medida en que se trata de una planta modelo de experimentación, con el genoma totalmente secuenciado, planta muy pequeña que produce numerosos descendientes, y con un tiempo de generación muy corto, lo que nos permite ahorrar espacio y tiempo. Por su parte, P. syringae es el modelo de fitopatógeno biotrofo. Los patógenos vegetales se clasifican como biotrofos o necrotrofos. En el caso de los biotrofos la fase más agresiva de crecimiento de la población bacteriana se produce en ausencia de muerte de las células del hospedador. Los necrotrofos estrictos provocan la muerte de las células del hospedador, como principal medida estratégica para la obtención de nutrientes, durante un estado temprano de la infección, lo que causa la consiguiente necrotización del tejido. P. syringae puede ser clasificado como un hemibiotrofo, en realidad, ya que si bien la fase más agresiva de incremento de la población se produce en ausencia de aparente muerte celular, en el último estado de la patogénesis (a menudo después de que las bacterias alcancen el pico poblacional en el apoplasto) las células del hospedador mueren y los tejidos infectados muestran una extensa necrosis.

Proceso de entrada de P. syringae en la planta

En primer lugar vamos a ver cómo tiene lugar el proceso de penetración de P. syringae pv. tomato DC3000 en una planta hospedadora como Arabidopsis thaliana. También existen muchas plantas a las que este fitopatógeno no ataca, son los denominados "non hosts" o no hospedadores. Las estrategias de resistencia de los no hospedadores constituyen precisamente la primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Estas estrategias consisten en múltiples capas de respuestas de defensa. En primer lugar se encuentra la cutícula, con sus muchas ceras recubriéndola, donde los productos antimicrobianos preformados constituyen la base o el fondo no específico de inmunidad de la planta. Los microorganismos que son capaces de atravesar esta barrera y tratar de penetrar en las células pueden quedar bloqueados en la superficie de la planta debido a la formación, por parte de la planta, de depósitos o papilas de la pared celular. De hecho, cualquier alteración de la integridad de la pared es inmediatamente respondida con la síntesis de compuestos de pared con objeto de lograr su reparación. Por ello los microorganismos que finalmente consiguen vulnerar las defensas pasivas de la planta son muy pocos. Y muchos de los que podrían vulnerarlas no tienen capacidad para multiplicarse dentro de los tejidos vegetales, lo que reduce aún más el rango de potenciales hospedadores de un patógeno.

Las cepas de P. syringae viven dos estilos de vida que están espacial y temporalmente interconectados: una fase inicial mayormente epifítica una vez que la bacteria llega a la superficie de una planta sana y, posteriormente, una fase endofítica en el apoplasto de la hoja. Muchos patógenos, tanto patógenos como saprófitos, son capaces de sobrevivir y proliferar en la superficie de la planta sin producir ninguna enfermedad (epifitos). Sin embargo, los patógenos foliares como P. syringae se pueden multiplicar de forma agresiva en el apoplasto (patógeno endofito). De este modo, si las condiciones son favorables finalmente se terminará produciendo la enfermedad.

La entrada en el tejido vegetal es el paso más crítico para que se establezca la infección foliar. Para acceder a los espacios intercelulares y a los tejidos internos de la hoja los patógenos deben cruzar la cutícula y la epidermis. Muchos hongos patógenos de plantas son capaces de penetrar directamente en la epidermis haciendo uso de la fuerza mecánica o de enzimas que degradan tanto la cutícula como la pared celular, o ambas cosas. Las bacterias, sin embargo, suelen usar otras estrategias para penetrar en los tejidos. Estas estrategias se basan, en general, en aprovechar caminos preexistentes. En el caso excepcional de Streptomyces scabies, el agente causante de la costra de la patata, la penetración se produce directamente a través de la pared pero en los tejidos en expansión que tienen una pared más delgada respecto a las células normales.

Las bacterias suelen aprovechar para penetrar todas las aberturas naturales de la planta y algunas no naturales que se producen por accidente. Entre las aberturas naturales las más importantes, porque dominan en número en la parte aérea de la planta, son los estomas. Los estomas controlan el intercambio de gases y la transpiración de agua entre el interior de la planta y el medio ambiente, y son los que aprovecha P. syringae para colarse dentro del tejido. No ostante, aunque se trate de las aberturas naturales más numerosas sólo suponen un 2% del total de la superficie. La probabilidad de que una bacteria inmigrante llegue justo a un estoma es baja, sobretodo porque es mucho más probable que la bacteria llegue al haz de la hoja y aquí hay muchos menos que en el envés. Existen, no obstante, otras aberturas naturales como los hidatodos, poros que exudan agua en los ápices de las hojas, que aprovecha Xanthomonas campestris pv. campestris, los nectarios, poros de secreción de néctar localizados en la emergencia de estilos y estambres y que son aprovechados por Erwinia amylovora, y las lenticelas, poros de respiración en tallos y raíces que aprovecha Pectobacterium atrosepticum. Las aberturas no naturales suelen deberse a heridas causadas por insectos, daño mecánico por helada, granizo, arena arrastrada por el viento, tormenta, o el daño causado por la formación de raíces laterales, ruptura de tricomas, o por abscisión de hojas.

Los estomas, la entrada que aprovecha P. syringae, son aberturas flanqueadas por un par de células especializadas llamadas células guarda. La apertura y cierre de los estomas depende del grado de turgencia de estas dos células. Cuando el ambiente es muy seco la planta tendrá la mayor parte de los estomas cerrados. En cambio, cuando la humedad ambiental sea elevada los estomas se abrirán. Las condiciones ambientales, como se ve, son trascendentales para favorecer o evitar las infecciones bacterianas. La apertura y cierre de los estomas está controlada por una hormona vegetal, el ácido abscísico (ABA) que interviene en las respuestas de la planta a la sequía y a otras situaciones de estrés abiótico. En la inoculación de P. syringae nosotros propiciamos que los estomas estén lo más abiertos posible controlando la humedad ambiental y el riego. En esta situación infiltramos una dilución de la bacteria en el envés de la hoja, donde hay más estomas, en un área grande a fin de provocar la aparición de síntomas de mayor tamaño y no una simple mancha. De este modo la respuesta también será mayor porque afectará a una cantidad mayor de tejido y así se podrá analizar mejor.

Primera línea de defensa de la planta

La planta va a empezar a defenderse de la invasión bacteriana desde el mismo momento en que detecta que las bacterias pretenden colarse por los estomas. Las células vegetales contienen receptores transmembrana específicos de diversas moléculas presentes en P. syringae. Estas moléculas se conocen en general como PAMPs o MAMPs (de "pathogen-associated molecular patterns" o "microbial-associated molecular patterns"). Los receptores vegetales que los reconocen se denominan, a su vez, PRRs, "pattern recognition receptors". Lógicamente serán las células guarda de los estomas las primeras de la planta en reconocer la presencia del patógeno a través de las PRRs y, por tanto, serán las primeras en generar una respuesta de defensa. Entre los PAMPs del patógeno más estudiados se encuentra un péptido de 22 aminoácidos (flg22) que aparece en cada una de las numerosas moléculas de la proteína flagelina que recubre el apéndice flagelar de la bacteria. Este péptido es reconocido de forma específica por una quinasa de la membrana plasmática de la célula vegetal (PRR) denominada FLS2 que inicia una cascada de reacciones que ponen en marcha la maquinaria de defensa que conduce al cierre de los estomas. Existen otros PAMPS, como el LPS (lipopolisacárido), si bien en este caso no se conoce el receptor específico, el RNP-1 ("RNA-binding motif"), y el factor de elongación Tu (EF-Tu).

¿Qué ocurre en la planta desde el punto de vista molecular? ¿En qué se traduce la respuesta de defensa que se desencadena frente a los PAMPs? Esta respuesta de defensa desencadenada por los PAMPs, y por ello conocida como PTI (de "PAMP-triggered innate immune response"), implica en primer lugar la formación de NO en las células guarda y de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como modificaciones en la pared celular (síntesis de callosa). El NO parece que es requerido para el cierre de los estomas. Las especies reactivas de oxígeno pretenden generar radicales libres en el patógeno que degraden sus membranas y su material genético. Además de la ruta de transducción de señales de los PAMPs, también se requiere ácido salicílico (SA, otra hormona vegetal que se induce siempre tras el ataque de P. syringae) y ácido abscísico (ABA) para el cierre de los estomas. De modo que debe haber una conexión entre la señalización de los PAMPs, la homeostasis de SA, y la homeostasis de ABA en la respuesta de las células guarda a la bacteria. Todavía queda bastante por estudiar para aclarar qué es lo que pasa. Además es posible que las células guarda de los estomas tengan propiedades de señalización únicas que requieran de análisis específicos para este tipo de células.

Si con la respuesta generada por la planta frente a los PAMPs hubiera sido suficiente para frenar el avance de la bacteria, aquí se habrían terminado las aspiraciones invasivas de P. syringae, pero desgraciadamente la bacteria aún dispone de una importante batería pesada con la que contraatacar a la planta.

Segunda línea de defensa de la planta

Lo cierto es que la bacteria contraataca y, a la vez, se defiende de todos los productos antimicrobianos que le hayan llegado desde la planta bombeándolos al exterior por medio de transportadores, y bloqueando las especies reactivas de oxígeno mediante la producción de enzimas que las degraden como catalasas, superóxido dismutasas, etc... y todo tipo de antioxidantes, además de las proteínas necesarias para la reparación de los daños en las membranas y en el ADN de las bacterias. En lo que respecta al contraataque, la batería pesada de factores de virulencia que saca la bacteria es enorme y refleja la adaptación que han sabido hacer las bacterias a lo largo de miles de años de evolución. Los dos factores de virulencia más conocidos y mejor caracterizados en P. syringae son la coronatina y los sistemas de secreción de tipo III. Factores de virulencia:

1.- En primer lugar, el fitopatógeno P. syrigae pv. tomato DC3000 produce una fitotoxina difusible denominada coronatina en el apoplasto y/o en la superficie de la hoja cuya consecuencia unas 3h después del momento de la infección será la reapertura de los estomas. No todos, claro, pero al menos sí un número elevado que permita a otras bacterias seguir colonizando el apoplasto de la hoja y dar lugar a un halo de clorosis alrededor del tejido infectado. La coronatina tiene dos componentes estructurales, el ácido coronafácico (CFA) y el ácido coronámico (CMA). No se conoce con exactitud el mecanismo molecular por medio del cual se produce la reapertura de los estomas, si bien parece que la coronatina está implicada y que su influencia es decisiva en los mecanismos de supresión temprana de la defensa. La coronatina, análogo estructural de otra hormona vegetal, el ácido jasmónico-Isoleucina (JA-Ile), es capaz de sustituir a este último ocasionando un desbalance de los niveles hormonales de la célula vegetal, que deberían estar más inclinados hacia la ruta SA-ABA para la defensa frente a P. syringae. Parece que es el desbalance de ABA y SA el que provoca la reapertura de los estomas. De hecho, se sabe que ambos son imprescindibles en la apertura de los estomas. No obstante, si bien la coronatina es necesaria para el cierre de los estomas en Arabidopsis y en tomate, lo cierto es que esta apertura de estomas también se produce en el caso de bacterias que no producen coronatina (y en el de hongos que producen otro tipo de toxinas), lo que necesariamente deberá implicar otros mecanismos. En cualquier caso sí parece que se produce una sinergia entre la coronatina y los efectores de tipo III en la apertura de estomas. También se produce esta sinergia en la inducción de la susceptibilidad de forma sistémica en las hojas.

2.- En segundo lugar, la bacteria patógena P. syringae pv. tomato DC3000 también inyecta efectores a través de un sistema de secreción de tipo III en las células del mesófilo. La finalidad última de esta secreción es anular las defensas del hospedador y liberar sus nutrientes. Las moléculas del fitopatógeno implicadas en estos procesos son mayoritariamente proteínas que interfieren en la maquinaria de síntesis y degradación de proteínas de la célula vegetal del hospedador, alterando así su homeostasis. Entre otras funciones, estos efectores despolimerizan la actina, intervienen en la fosforilación y defosforilación de proteínas alterando las rutas de transducción de señales, y activan los mecanismos de apoptosis.

Dado que los patógenos de plantas tienen que activar de forma coordinada sus mecanismos de virulencia durante la infección en la planta, es esperable que los genes de virulencia tengan elementos comunes en sus promotores para que puedan ser activados por factores transcripcionales o factores sigma comunes. Así, por ejemplo, en P. syringae y Erwinia amylovora los genes que codifican las proteínas efectoras y los componentes estructurales del sistema de secreción de tipo III están precedidos por promotores que contienen la caja consenso hrp. El factor sigma alternativo HrpL se induce durante la infección y éste, a su vez, se une a los promotores y activa los genes codificantes de las proteínas efectoras y los del sistema de secreción de tipo III. En el caso de Xanthomonas los genes efectores y los de los componentes del sistema de secreción de tipo III están precedidos por promotores que llevan la caja PIP. En el caso de Ralstonia solanacearum la caja consenso en el promotor de estos genes es la hrpII. De ahí que una forma de encontrar genes implicados en la virulencia de las bacterias fitopatógenas sea localizando estas cajas en los promotores ya que la corregulación de los genes efectores y de los que codifican el sistema de secreción de tipo III es bastante común en bacterias. Otra característica común de los genes de virulencia (los efectores y el sistema de secreción) es que se encuentran en zonas aisladas del genoma que se denominan islas de patogenicidad. El genoma nuclear es el que han heredado verticalmente todos los miembros de una especie bacteriana desde un ancestro común. Las islas de patogenicidad corresponden a zonas flexibles del genoma que se han adquirido por transferencia horizontal a algunos miembros de la especie. Normalmente, esta parte del genoma tiene su origen en genomas bacterianos no relacionados o en bacteriófagos. En el caso particular de la bacteria Gram-positiva Streptomyces scabies, el agente causante de la costra de la patata, y Streptomyces coelicolor, una bacteria del suelo estrechamente relacionada con la anterior y no patógena, la única diferencia entre ellas es la presencia de una única isla grande de patogenicidad que contiene numerosos genes de virulencia.

La secreción de proteínas juega un papel central en la modulación de las interacciones de las bacterias con su medio ambiente. Esto es precisamente lo que ocurre cuando las bacterias simbióticas, ya sean patógenas, comensales, o mutualistas, interaccionan con sus hospedadores. En el caso concreto de las bacterias Gram-negativas, la secreción requiere la translocación a través de las membranas interna y externa, y se han elaborado una diversidad de máquinas moleculares con esta finalidad. Numerosas proteínas de secreción están destinadas a entrar dentro del hospedador (efectores y toxinas), y por ello existen varios sistemas de secreción que incluyen un aparato de translocación de proteínas a través de la membrana plasmática del hospedador. Las bacterias Gram-negativas tienen seis sistemas de secreción diferentes, algunos de los cuales son compartidos también por las Gram-positivas que, además, tienen otro sistema específico de translocación, el VII, propio de las micobacterias ya que disponen de una pared celular hidrofóbica, casi impermeable, llamada micomembrana. En las bacterias Gram-negativas algunas proteínas se exportan a través de las membranas interna y externa en un solo paso mediante los sistemas de tipo I, III, IV, y VI. Sin embargo, otras proteínas se exportan primero al espacio periplásmico mediante el sistema universal Sec (secreción de proteínas en su forma desplegada) o TAT (secreción de proteínas plegadas), y luego se translocan a través de la membrana externa por medio de los sistemas de tipo II, V, o menos frecuentemente, I ó IV. En cambio, en las bacterias Gram-positivas los sistemas de translocación más comunes son el Sec o el TAT. Ahora vamos a hacer un rápido repaso por los sistemas de secreción más representados en las bacterias fitopatógenas.

SISTEMAS DE SECRECIÓN EN BACTERIAS FITOPATÓGENAS:

Los fitopatógenos Agrobacterium tumefaciens, P. syringae pv. tomato, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas axonopodis pv. citri y Xylella fastidiosa secretan factores de virulencia como metaloproteasas, proteínas de adhesión y glucanasas por medio de sistemas de secreción de tipo I. Los rizobios también usan este sistema para secretar proteínas que determinan la especificidad del hospedador y están implicadas en la formación de biofilm.

El sistema de secreción de tipo II es dependiente del sistema Sec para exportar proteínas al periplasma. Aunque el sistema Sec es universal, en cambio el sistema de secreción de tipo II es exclusivo de las bacterias Gram-negativas. Este sistema es el que transloca los factores de virulencia de los patógenos humanos Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, y la enteropatógena Escherichia coli, y los fitopatógenos Ralstonia solanacearum, Pectobacterium atrosepticum (Erwinia carotovora subsp. atroseptica) y Xanthomonas campestris pv. campestris. Sirve para la secreción de pectinasas y pectato liasas por parte de los fitopatógenos Dickeya dadantii (Erwinia chrysanthemi), Erwinia amylovora y Xanthomonas campestris pv. campestris. Sin embargo, miembros de las rizobiáceas como el fitopatógeno Agrobacterium tumefaciens y el mutualista Sinorhizobium meliloti carecen de este sistema de secreción.

El sistema de secreción de tipo III se encuentra en bacterias Gram-negativas que interaccionan con hospedadores animales o plantas, ya sea como patógenos o mutualistas. La maquinaria del sistema de secreción de tipo III, denominada inyectiosoma, parece tener un origen evolutivo común con el flagelo. La principal función conocida del inyectiosoma es la liberación de proteínas efectoras en el citosol de las células del hospedador tras atravesar las membranas de la bacteria y del hospedador. En el citosol del hospedador los efectores modulan una gran variedad de funciones de la célula hospedadora, incluyendo la respuesta inmune o de defensa. En otros casos el sistema secreta proteínas efectoras simplemente al exterior. Si bien inicialmente estos sistemas de secreción se identificaron con bacterias patógenas, luego se han descrito en bacterias mutualistas de plantas, como los rizobios, la mosca tsé-tsé, el nemátodo Photorhabdus luminescens y de humanos, lo que indica que el sistema de secreción de tipo III es una puerta general de entrada en las asociaciones bacteria-hospedador más que algo exclusivo de la patogénesis.

Se conocen siete familias diferentes de sistemas de secreción de tipo III. Los patógenos de plantas tienen sistemas de secreción de tipo III de dos de estas familias (Hrp1 y Hrp2) en tanto que el sistema de secreción de tipo III de las rizobacterias forma una tercera familia. Algunas bacterias pueden tener más de un sistema de secreción de tipo III, a veces codificado por distintas islas de patogenicidad (lo normal es que se codifiquen en islas de patogenicidad o en plásmidos sujetos a la transferencia horizontal). Se necesitan hasta 25 proteínas para codificar y ensamblar el inyectiosoma, pero sólo 9 están conservadas en las 7 familias (llamadas Hrc en el caso de los patógenos), 8 de las cuales se conservan en el flagelo.

La estructura y función del inyectiosoma ha sido bien estudiada en los patógenos animales Salmonella typhimurium y Yersinia pestis, así como en el fitopatógeno Pseudomonas syringae. La estructura básica está compuesta de una serie de anillos basales que se extienden desde la membrana interna a la externa y se conectan a una especie de aguja hueca (en Yersinia), a un filamento (en Salmonella) o a un pilus (en P. syringae). Cada estructura termina en una punta con un poro de translocación que es insertado dentro de la membrana plasmática de la célula diana. Una ATPasa conservada se asocia con la base citoplásmica del inyectioma en la bacteria y aporta la energía necesaria para el transporte. Dos clases de chaperonas ayudan en el ensamblaje del inyectiosoma, mientras que una tercera clase de chaperonas asiste en la translocación de las proteínas efectoras.

Para liberar factores de virulencia ni Firmicutes ni Actinobacterias tienen un sistema secretor de tipo III. Así que ¿cómo se las apañan para atravesar las paredes celulares y la membrana plasmática? En particular, como vimos, Streptomyces scabies, S. turgidiscabies, y S. acidiscabies atraviesan directamente las paredes celulares con la ayuda de la thaxtomina, una fitotoxina que inhibe la biosíntesis de celulosa, lo que presumiblemente permite la liberación de proteínas en el interior de las células. Por su parte, espiroplasmas y fitoplasmas son inyectados dentro del citoplasma de las células vegetales por los insectos vectores. A continuación los patógenos secretan proteínas en el citoplasma de las células del floema. Estas proteínas se mueven a otras células de la planta (células sumidero) por medio de los plasmodesmos.

Los sistemas de secreción de tipo IV, a diferencia de otros sistemas de secreción, son un sistema único en cuanto a su capacidad para transportar ácidos nucléicos, además de proteínas, dentro de las células de animales o plantas, así como dentro de levaduras y de otras bacterias. También extiende desde la membrana interna hasta la externa de una bacteria Gram-negativa o a través de la membrana y la pared celular de una bacteria Gram-positiva. Muchos organismos tienen este sistema de secreción, entre los que se encuentran los patógenos Agrobacterium tumefaciens, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis, Escherichia coli, Legionella pneumophila y el mutualista fijador de nitrógeno Mesorhizobium loti. Aunque estos sistemas comparten parecido funcional, no todos están codificados por los mismos conjuntos de genes. La única proteína en común entre todos los sistemas caracterizados es VirB10 (TrbI). Aunque este sistema está muy ligado a la patogénesis, no todas las bacterias patógenas lo tienen.

El organismo modelo para el estudio del sistema de transporte de tipo IV es Agrobacterium tumefaciens C58. Su sistema VirB es capaz de exportar complejos ADN-proteína desde su plásmido Ti hasta el hospedador. Esta inyección de ADN dentro del hospedador es un mecanismo de virulencia porque las células transformadas se multiplican de forma cancerosa formando tumores o agallas de corona. Entre los genes que inserta el patógeno en el hospedador se encuentran, además de los que descontrolan la multiplicación de las células, los que codifican opinas, fuente de carbono y de nitrógeno específicos del patógeno que, así, crece a sus anchas. La mayoría de las proteínas VirB son responsables de la formación de la compleja estructura de la maquinaria secretora.

Aunque se conocen muchas proteínas secretadas por el sistema de secreción de tipo V, más incluso que por el sistema de tipo II, la mayoría de las proteínas caracterizadas hasta la fecha contribuyen a la virulencia de patógenos de animales o de humanos.

El sistema de transporte que se ha caracterizado más recientemente es el sistema de secreción de tipo VI, en 2006. Es parecido a los sitemas III y IV, y se ha encontrado tanto en patógenos de animales y humanos, como en patógenos de plantas como Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, y Xanthomonas oryzae. Además parece ser necesario para la eficiente colonización de la raíz de los mutualistas fijadores de nitrógeno Mesorhizobium loti y Rhizobium leguminosarum. El mecanismo de funcionamiento es similar al del inyectiosoma e incluye una chaperona citoplásmica con actividad ATPasa, un canal que va de la membrana interna a la externa y una aguja apuntada con una proteína que forma un poro. Algunos componentes de la maquinaria pueden actuar como efectores y ser traslocados dentro de las células hospedadoras.

Después de este repaso por los distintos sistemas de secreción de efectores retomamos a P. syringae. Destacamos que la patogenicidad de P. syringae DC3000 se parece a la de la mayor parte de patógenos de animales y plantas dentro de las gamma-Proteobacteria que cuentan con un sistema de secreción de tipo III para inyectar proteínas efectoras de virulencia dentro de las células hospedadoras. La patogenicidad de esta cepa se parece a la de muchos patógenos importantes de plantas (bacterias y hongos) en los que la especificidad del hospedador está controlada por las interacciones gen a gen en las que un alelo dominante en el hospedador y un alelo dominante en el patógeno condicionan el resultado de la interacción entre la planta y el patógeno.

En P. syringae el conjunto de proteínas que constituyen el inyectiosoma del sistema de secreción de tipo III, y algunas de las proteínas efectoras, están codificadas por los genes hrp, todos ellos regulados por el factor sigma alternativo HrpL que, a su vez, es regulado positivamente por el sistema de dos componentes HrpSR dependiente del factor de transcripción RpoN. Otras proteínas efectoras están codificadas por los genes avr, y también dependen transcripcionalmente de HrpL. La primera conexión entre el operón hrp y el sistema de secreción de tipo III ocurrió con Yersinia pestis. En plantas el análisis más exhaustivo se ha completado precisamente en P. syringae pv. tomato DC3000. Como señalamos antes, este patógeno de Arabidopsis y tomate puede desplegar hasta 50 proteínas efectoras. En este patógeno se ha demostrado que HrpA es la proteína estructural de la aguja del inyectiosoma o pilus que atraviesa la pared vegetal. Incluso se ha comprobado cómo se acumulan a lo largo del pilus algunas de las proteínas que son secretadas por este sistema de secreción de tipo III como HrpZ y AvrPto.

3.- Otro de los factores de virulencia a los que recurre P. syringae pv. tomato DC3000 es la hormona auxina (ácido indol acético, IAA), lo que contribuye aún más a desbalancear las hormonas de la planta. La auxina interviene en los procesos de proliferación celular y agrandamiento del tamaño de las células. De este modo se consigue un doble efecto. Por un lado, que la planta distraiga en desarrollarse parte de la energía que debería emplear en defenderse. Por otro lado, hacer más vulnerable a la planta ya que, cuando las células están creciendo la pared celular es más delgada y, por tanto, más fácil de atacar. Una planta que se defiende de forma activa reprime inmediatamente la maquinaria de síntesis de auxinas y el crecimiento en general.

4.- Junto con todos los factores de virulencia anteriores las bacterias patógenas sintetizan numerosas enzimas y transportadores que favorezcan su estrategia total de ataque. Tal es el caso de las enzimas que están implicadas en la degradación de la pared celular, la captación de hierro, que así dejará de estar disponible para la planta, y la captación de nutrientes.

¿Cuál es el resultado de todos estos factores de virulencia para la planta?

Hemos llegado a un punto crítico. La bacteria ha demostrado que tiene armas para contraatacar cuando la planta ha puesto en marcha su batería de defensa PTI al reconocer los PAMPs. Está claro que si la célula no es capaz de hacer uso de otros mecanismos de defensa, si no dispone de una segunda línea de defensa, lo más probable es que la planta termine muriendo tras ser pasto de las bacterias que podrán, a continuación, colonizar los tejidos adyacentes y así, poco a poco ir destruyendo todo el tejido foliar. Arabidopsis es una planta susceptible, al igual que el tomate, al ataque de P. syringae. La bacteria es capaz de inducir la aparición de enfemedad en la planta si las condiciones ambientales son favorables, enfermedad que progresará por todo el tejido foliar. A esta interacción entre Arabidopsis o tomate con la bacteria P. syringae pv. tomato DC3000 se le da el nombre de COMPATIBLE. Así que desde el punto de vista de la planta, ser compatible con un determinado fitopatógeno, es lo peor que puede pasar.

Sin embargo, sabemos que la inoculación de esta bacteria en otros hospedadores, que denominaremos NO COMPATIBLES, no conduce al desarrollo de la enfermedad, sino a una respuesta de defensa por parte de la planta que ataja el desarrollo del patógeno. Estas plantas sí disponen de esa segunda línea de defensa de la que estamos hablando. La PTE (de "Effector-triggered innate immune response") que recibe este nombre precisamente porque la respuesta de defensa se desencadena tras el reconocimiento de alguno de los efectores que ha liberado la bacteria dentro de la célula vegetal a través del sistema de secreción de tipo III. Podemos convertir el patosistema compatible que hemos estado estudiando en detalle (Arabidopsis y P. syringae pv. tomato DC3000) en incompatible cambiando la planta o cambiando la bacteria. Elegimos cambiar la bacteria. El cambio va a ser muy pequeño pero trascendental. Simplemente vamos a añadir a la bacteria anterior un plásmido resistente a Tetraciclina que codifica un gen efector que normalmente lleva otra cepa de P. syringae pv. maculicola. Esta cepa ataca normalmente a la familia de las crucíferas y el gen al que me refiero es avrRpm1. Nuestro nuevo patosistema está formado por Arabidopsis thaliana y P. syringae pv. tomato DC3000 (avrRpm1). En este nuevo patosistema la relación que se establece entre hospedador y patógeno es incompatible. ¿Qué poder mágico tiene la proteína codificada AvrRpm1 de la bacteria? Ya hemos dicho que AvrRpm1 es el nuevo efector que la cepa DC3000 de P. syringae pv. tomato inyecta por su sistema de secreción de tipo III en Arabidopsis, junto con todos los que inyectaba antes. Pues bien, Arabidopsis tiene un sistema de proteínas que reconocen perfectamente al nuevo efector y ponen en marcha la nueva máquina defensiva ETI. Ahora Arabidopsis se hace rápidamente "consciente" de que está siendo contraatacada tras su respuesta PTI y lanza una contraofensiva contundente, la ETI.

¿En qué consiste la contraeofensiva ETI? En la producción mayoritaria, por parte de la planta, de
especies reactivas de oxígeno (ROS) que además de matar a la bacteria van a provocar la muerte celular programada de las propias células vegetales. Esto es lo que se conoce como HR o respuesta hipersensible. ¿Pero qué forma de defederse es ésta en la que se matan las propias células? Bueno, este tipo de respuestas tienen la misión de evitar que las bacterias se desarrollen y se propaguen. Se lleva a cabo una especie de amputación del tejido infectado, lo que hará que la bacteria quede confinada al tejido infectado e impedirá que la enfermedad siga avanzando. En este caso decimos que la planta y la bacteria mantienen una relación incompatible. Este tipo de respuesta inmune está bien descrita desde el punto de vista molecular mediante lo que se conoce como el modelo gen a gen. Este modelo, cuyo funcionamiento fue demostrado hace veinticinco años, consiste en que existe un gen avr en el patógeno que codifica un efector de virulencia Avr que es reconocido por el producto R de un alelo dominante R de la planta. Una vez que R reconoce a Avr se dispara una cascada de reacciones que ponen en marcha la respuesta hipersensible o HR. En nuestro caso concreto el efector AvrRpm1 ha sido reconocido de alguna manera por la proteína RPM1 de la planta. La proteína de resistencia RPM1 tiene capacidad para reconocer tanto al efector AvrRpm1 como al AvrB, así que hubiéramos obtenido el mismo resultado si, en vez de transformar a P. syringae pv. tomato DC3000 con un plásmido que contuviera el gen avrRpm1, la hubiéramos transformado con un plásmido que contuviese el gen avrB. RPM1 desencadena la respuesta hipersensible con ambos efectores, AvrRpm1 y AvrB, aunque éstos no se parezcan entre sí.

La presencia del gen R de la planta codificante de la proteína de resistencia R determina la naturaleza dual de los efectores de los patógenos, ya que en unos casos son considerados factores de virulencia y en otros de avirulencia. Si la planta no contiene la correspondiente proteína R que reconoce al efector Avr, la planta no podrá desencadenar la HR y, por tanto, el efector Avr se considerará un factor de virulencia. En cambio, en aquellos casos en los que el efector Avr sea reconocido por una proteína R, la planta activará la HR a las 24h, se defenderá, y el efector se considerará en tal caso un factor de avirulencia. Al primer tipo de interacción planta-bacteria se le considerará compatible y a la planta SUSCEPTIBLE. En cambio, al segundo tipo de interacción en la que la planta se defiende del patógeno la consideramos incompatible, y a la planta RESISTENTE.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS PROTEÍNAS R DE RESISTENCIA EN PLANTAS:

Los genes R codifican sobretodo sensores intracelulares que desencadenan la respesta hpersensible. En general contienen un dominio central de unión a ADN, y un dominio C-terminal de Leucinas repetidas (LRRs). Estructuralmente, las proteínas R están relacionadas con los receptores del sistema inmune de los vertebrados. A diferencia de los efectores Avr de los patógenos, en los que ya se ha comprobado que no se parecen entre sí, en cambio, las proteínas R sí tienen estructuras parecidas. Los motivos de Leu repetidas (LRRs) se cre que están involucrados en la interacción proteína-proteína, ya sea con las proteínas efectoras del patógeno o con otras proteínas de la planta. Algunas proteínas LRR tienen dominios extracelulares en tanto que otras son citoplásmicas, aunque puedan estar asociadas a la membrana plasmática como RPM1.

El reconocimiento que hace la proteína R del efector Avr raramente suele ser directo. Lo normal es que este reconocimiento se lleve a cabo a través de una proteína intermedia presente en la planta. El hecho de que la misma proteína que reconoce al efector sea la que inicie la cascada de reacciones que constituyen la respuesta hipersensible HR es casi una excepción, más que la norma general. El caso más habitual es aquel en el que la proteína R actua como guardia molecular de la proteína diana del efector o proteína intermediaria, lo que coincide con la conocida como "hipótesis guardia". En otras ocasiones el efecto indirecto se produce porque el efector se une directamente al promotor de los genes del hospedador activando su expresión.

¿Cómo podemos diferenciar en la planta una respuesta de defensa HR de una reacción de susceptibilidad? ¿Cuál es la sintomatología asociada a estos procesos? Tras la inoculación de hojas de Arabidopsis thaliana con una dilución de bacterias de 10 elevado a 6 por mililitro, nos encontramos los siguientes síntomas:

Interacción compatible: En el caso de la inoculación con la bacteria que consideramos virulenta (P. syringae pv. tomato DC3000) podemos observar un halo de clorosis bastante ancho que avanza hacia afuera, dentro del cual aparece una lesión húmeda necrótica que corresponde a las células que mueren en los últimos estadíos de la infección. Esta reacción de SUSCEPTIBILIDAD se puede ver claramente entre las 48 y las 72h.

Foto cortesía de Jorge Vicente, Centro Nacional de Biotecnología CNB-CSIC

Interacción incompatible: Al inocular con la bacteria avirulenta (P. syringae pv. tomato DC3000 (avrRpm1)) nos encontramos una lesión necrótica que ya se distingue bien a las 24h y donde apenas existe clorosis o un halo mínimo. En esta reacción de RESISTENCIA no existe avance del frente y, al final, lo que queda se parece a una cicatriz.

Foto cortesía de Jorge Vicente, Centro Nacional de Biotecnología CNB-CSIC

A continuación vamos a estudiar los detalles moleculares del proceso de reconocimiento del efector AvrRpm1 tanto en la interacción compatible como en la incompatible. Una vez que el efector AvrRpm1 llega al citoplasma de la célula vegetal de Arabidopsis thaliana, una proteína de la planta, RIN4, es la diana a la que se une dicho efector bacteriano. Posteriormente, la proteína de resistencia RPM1, guardián de RIN4 reconoce un cambio conformacional en RIN4 y activa la respuesta de defensa. El efector AvrB, por el contrario, tiene capacidad para interaccionar directamente con RPM1. La proteína vegetal RIN4 se localiza en la membrana plasmática y tiene una función bioquímica desconocida. Tampoco se conoce exactamente la función bioquímica de AvrRpm1 y AvrB, lo que sí se sabe es que inducen la fosforilación de RIN4 en plantas. Si bien aún no se sabe si los efectores son es quinasas funcionales, es decir, si tienen capacidad para fosforilar directamente RIN4 o, en cambio, se induce su fosforilación a través de una quinasa de la planta. El sistema ha evolucionado con la aparición de otros efectores que tienen otra actividad bioquímica sobre RIN4, como por ejemplo AvrRpt2 que actúa como una proteasa sobre RIN4, evitando de este modo la activación de RPM1 a través de AvrRpm1 y AvrB. RPM1 confirma la "hipótesis guardia" de la defensa vegetal según la cual RPM1 se comporta como el guardia molecular que impide a los efectores bacterianos sacar ventaja, aprovecharse, de otra proteína de la planta, RIN4, rebajando así las defensas basales de la planta. Sin embargo, es imprescindible que RIN4 interaccione con RPM1 para que ésta active la respuesta HR en la planta frente a los dos efectores bacterianos AvrRpm1 y AvrB de P. syringae, inhibiendo el crecimiento bacteriano. Esta respuesta no se da en plantas con niveles bajos de RIN4. Bajos niveles de RIN4 dan lugar a bajos niveles de RPM1 y, por razones deconocidas, baja la capacidad de resistencia de la planta tanto a P. syringae como al hongo no relacionado Peronospora parasitica. Cuando plantas susceptibles son infectadas con P. syringae, las proteínas Avr interaccionan con RIN4, inducen su fosforilación e incrementan su concentración, lo que lleva a la inhibición de las defensas basales y, por tanto, a la susceptibilidad. En cambio, cuando las plantas son resistentes a P. syringae, todas estas manipulaciones son de alguna manera sensadas por RPM1, que pone en marcha el programa de muerte celular programada que da lugar a la resistencia.

¿Qué dice la mejora vegetal de todo esto?

A simple vista, resolver el problema de la patogénesis puede parecer muy sencillo. Bastaría con introducir en el patógeno un gen externo que codifique un producto que pueda ser reconocido por la planta para que ésta desencadene la respuesta hipersensible. También se le puede introducir a la planta un gen de resistencia que reconozca al efector del patógeno. Sin duda se trataría de pasos importantes, si bien no hay que olvidar que las bacterias continuarán evolucionando hasta que consigan burlar el reconocimiento por parte de la planta. Por eso se sigue investigando en los mecanismos de resistencia, en especial de las plantas no hospedadoras que, tal vez, lo que tengan sea un montón de proteínas de resistencia para reconocer muchos posibles efectores. Pero lo que sí es cierto es que su resitencia es mucho más estable en campo, la evolución de los patógenos no burla tan pronto esa defensa y, por ello, seguro que emplea mecanismos mucho más interesantes que se pueden incorporar a las plantas de cultivo para que se defiendan mejor de las infecciones bacterianas.

¿Quién controla todo el proceso de virulencia en P. syringae pv. tomato DC3000?

Lo que sabemos actualmente es que un sistema de dos componentes sensor-regulador GacA-GacS es el regulador central de la virulencia de esta bacteria puesto que controla la comunicación celular o "quorum sensing", la síntesis de sistema de secreción de tipo III y de los efectores correspondientes, la síntesis de coronatina, la mobilidad, la síntesis de alginatos y polisacáridos extracelulares, y la síntesis de pigmentos. El sistema Gac se activa en el apoplasto del hospedador por una combinación de señales, incluyendo el bajo pH, baja osmolaridad, presencia de azúcares sacarosa o fructosa, y carencia de fuentes complejas de carbono y nitrógeno. Sin embargo, las señales exactas que recibe GacS y el mecanismo de interacción GacA-GacS siguen siendo desconocidos. Además, los procesos moleculares por los que GacA/S regula los reguladores que están aguas abajo son muy desconocidos. Lo que sí está claro, y constituye una de las principales diferencias con otras bacterias Gram-negativas como X. campestris pv. campestris, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, y Ralstonia solanacearum, es que el sistema de comunicación celular no parece ser el primer paso en la jerarquía reguladora de la virulencia, donde una molécula difusible activa la mayoría de las respuestas de virulencia. Por el contrario, y como ya he señalado, el sistema de transducción de dos componentes GacA/GacS es el que controla el sistema sensor/regulador AhlI/AhlR de comunicación celular. Este sistema de comunicación es, sin embargo, esencial para la maceración del tejido intercelular del hospedador, y también para mantener el "fitness" de la bacteria durante la etapa de vida epifítica, ya que controla la producción de exopolisacáridos y la movilidad en masa en ambientes diversos. Al regular la movilidad en masa, el "quorum sensing" se convierte en el medio de dispersión de los agregados epifíticos en la superficie de la hoja. Por este motivo, el sistema de comunicación celular AhlI/AhlR es importante para controlar la virulencia de diferentes estados de vida de la bacteria y de la infección. No obstante, el regulón completo de genes controlados y los mecanismos mediante los que se regulan AhlI/AhlR son desconocidos.

Pectobacterium carotovorum

Continuando nuestro recorrido por las distintas familias de bacterias Gram-negativas que existen dentro del phylum Proteobacteria, clase gamma-Proteobacterias, pasamos a la familia de las Enterobacteriáceas.

Anteriormente conocida como Erwinia carotovora subsp. carotovora, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum es un patógeno necrotrofo que tiene numerosos hospedadores. Vive como un epifito o como un saprófito en el suelo y en el agua de riego hasta que encuentra un hospedador susceptible. Secreta enzimas pectolíticas para macerar el tejido del hospedador. Es causante de la podredumbre del tallo o pie negro de la patata.

A diferencia de P. syringae pv. tomato DC3000, son las sustancias responsables de la comunicación celular las que regulan la expresión global de los genes de virulencia, en particular el sistema de secreción de tipo III, las enzimas de degradación de la pared celular (PCWDE), y la producción de antibióticos. En este caso, y nuevamente al contrario de lo que ocurría en P. syringae, los sitemas de dos componentes sólo complementan la regulación global de la virulencia.

Cada especie de Pectobacterium infecta patata a distinta temperatura óptima, lo que se relaciona con diferencias en su distribución geográfica. Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum y Pectobacterium chrysanthemi producen la enfermedad sobretodo en regiones tropicales y subtropicales, mientras que Pectobacterium atrosepticum produce la enfermedad en regiones templadas y frías.

Pectobacterium atrosepticum, anteriormente Erwinia carotovora subsp. atroseptica fue la primera enterobacteria patógena de plantas en ser secuenciada. Provoca una podredumbre negra en los tallos de la patata. La aparición de la enfermedad depende mucho de las condiciones de crecimiento, sobretodo de la temperatura y de las lluvias después de la siembra. Los síntomas de maceración del tejido se deben a la prolífica producción de múltiples enzimas de degradación de la pared celular. Esta bacteria produce enfermedad casi exclusivamente en patata, extendiéndose desde los lugares iniciales de infección en los tubérculos contaminados hasta el tallo donde produce las sintomáticas manchas negras, y viaja a través de los estolones o el suelo hasta los tubérculos en formación, donde produce la podredumbre blanda. Una vez que alcanza la progenie de tubérculos, la bacteria puede entrar por las lenticelas y allí permanecer como infección latente hasta que las condiciones ambientales favorezcan la multiplicación celular y el desarrollo de la enfermedad. Entre los estímulos ambientales que inician este proceso se encuentran la temperatura y la baja concentración de oxígeno.

Xanthomonas campestris pv. campestris

Siguiendo con la clase gamma-Proteobacteria, pasamos al representante que da nombre a la familia de las Xantomonadáceas, Xanthomonas campestris. Esta especie de fitopatógeno se divide en 141 patovares que infectan un amplio rango de plantas incluyendo muchas de interés agrícola, como por ejemplo el repollo, la coliflor, el brécol (X. c. pv. campestris), el tomate y el pimiento (X. c. pv. vesicatoria), el algódón (X. c. pv. malvacearum), la soja (X. c. pv. glycines), y el nogal (X. c. pv. juglandis). Por su parte, Xanthomonas campestris pv. campestris es el hemibiotrofo agente causal de la podredumbre negra en las crucíferas, posiblemente la enfermedad más importante de las crucíferas en todo el mundo.

Lo mismo que P. syringae, tiene la capacidad de vivir como epifito en la superficie de las hojas. Produce un pigmento amarillo llamado xanthomonadina que contribuye a la supervivencia de la bacteria en condiciones epifíticas. Invade el xilema de las plantas a través de unas aberturas llamadas hidatodos localizados en el borde superior de las hojas. En repollo produce una lesión en forma de V en la parte superior de la hoja indicativa de que la bacteria entró por el hidatodo. A veces entra por los estomas y produce lesiones circulares. Seguidamente se desplaza de la vena media a las venas laterales del xilema, seguramente gracias a la acción de las enzimas extracelulares que pueden contribuir a la digestión de los tejidos del xilema. Si el tejido resulta muy dañado por el excesivo crecimiento del patógeno, éste se desplazará al apoplasto. En el sistema vascular produce un polisacárido extracelular (EPS) llamado xanthan que puede obstruir los vasos del xilema, causando la necrosis del tejido y un severo marchitamiento de la hoja. Además, hay evidencias de que el xanthan puede jugar otros papeles en la infección. El tratamiento de las hojas con xanthan suprime la acumulación de callosa y aumenta la susceptibilidad de la planta. Además, forma parte de los biofilms donde puede quedar protegida la bacteria. Y, puesto que es una goma muy estable y no tóxica ni irritante, tiene múltiples aplicaciones en la industria y la alimentación.

Las comunicaciones intercelulares en esta bacteria por medio del "quorum sensing" son cruciales en la regulación global de la virulencia y de las funciones celulares básicas. El sistema parte de una señal difusible (DSF) que a la postre regula la mobilidad, la resistencia al estrés oxidativo y a la presencia de toxinas, la respiración aeróbica, la formación de biofilm, y la producción de enzimas y polisacáridos extracelualres (EPS). Este es un caso especial en el que el sistema de dos componentes RpfC/RpfG controla la comunicación celular y, a la vez, es el regulador general de la virulencia. No obstante, sólo cuando se conozcan todos los elementos de la red de regulación se podrá determinar claramente la importancia de RpfC y RpfG.

Xylella fastidiosa

Otra bacteria que forma parte de la familia Xanthomonadáceas es Xylella fastidiosa. Esta bacteria es el agente causante de una especie de asurado/chamuscado de las hojas que afecta a muchas especies diferentes de árboles de sombra, como el olmo, el arce, y un gran número de especies de roble. El rango de hospedadores de esta bacteria en muy grande, y produce enfermedades en hospedadores importantes desde el punto de visto económico como la vid en las que los síntomas típicos son el asurado y el marchitamiento de las hojas. También afecta a árboles ornamentales comunes.

La vida de Xylella fastidiosa está limitada a los vasos del xilema de las plantas hospedadoras, y la bacteria es transmitida por insectos vectores que se alimentan del xilema. Los desplazamientos de la bacteria están limitados al xilema y pasa de unos vasos a otros mediante la degradación/disolución de las paredes celulares de unas pequeñas invaginaciones o "pits" que separan los vasos del xilema. El comportamiento y la expresión de genes en la bacteria varía según el estadío de la infección. Al principio, cuando los síntomas aún no son manifiestos en las hojas y la densidad de bacterias en los vasos aún es baja, las bacterias son muy móviles, aunque se trate de una bacteria no flajelada (pero tiene pili "largos" de tipo IV), y sintetizan un gran número de enzimas que degradan las paredes de los "pits". En los estados más avanzados de la enfermedad, cuando los síntomas son visibles en las hojas, y la densidad de bacterias en los vasos es elevada, las bacterias son menos móviles, tienen pili "cortos" de tipo I, cuya función es sobretodo la adherencia a las superficies, y producen una especie de goma parecida al xanthan de Xanthomonas. Este es el momento en que los insectos vectores recogen las bacterias con su estilete y se inicia la multiplicación dentro del insecto y, a la vez, un nuevo ciclo de infección en otras plantas. La movilidad y la adhesión son procesos que se oponen mutuamente. Seguramente será necesario mantener el balance adecuado entre los dos tipos de pili en cada momento del ciclo de infección y desarrollo de la enfermedad (cortos para agarrarse al insecto y largos para desplazarse entre los vasos del xilema).

La densidad poblacional también se controla en esta especie por medio de la producción de señales difusibles (DSF). Su acumulación informa a las bacterias de que la densidad de la población está aumentando. Y, cuando ésta sea lo bastante elevada, se activará la expresión de los genes propios de los estadíos finales de la enfermedad.

Un aspecto destacable de esta bacteria es que no tiene sistema de secreción de tipo III, y aparentemente tampoco tiene los efectores que se secretan por medio de estos sistemas. Usa mayoritariamente el sistema de secreción de tipo I. La carencia de sistema de secreción de tipo III se debe, probablemente, a que Xylella fastidiosa no tiene necesidad de contraatacar en las células de la planta. Las células del xilema en muchos casos son células muertas, y éstas no tienen una respuesta de defensa PTI. Tampoco existe evidencia de la colonización de células vivas parenquimáticas adyacentes.

Agrobacterium tumefaciens

Dentro de las bacterias Gram-negativas, phylum Proteobacteria, clase alfa-Proteobacteria, encontramos una familia muy importante por las consecuencias positivas que tiene para las plantas, las Rhizobiaceae. Entre los miembros más conocidos de la familia Rhizobiaceae se encuentran los fijadores de nitrógeno de los géneros Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, etc... que mantiene una interacción mutualista con las plantas leguminosas a las que nodulan. De esta relación simbiótica se benefician tanto las bacterias como las plantas. Sin embargo, en esta familia tan amistosa también hay una "oveja negra", si se me permite la metáfora, que es Agrobacterium tumefaciens. No obstante, nosotros los humanos hemos sido capaces de aprovechar alguna de las principales características que tiene esta especie en el desarrollo de la biotecnología de plantas, como veremos a continuación.

Agrobacterium tumefaciens da lugar a la formación de unas masas celulares denominadas agallas que se encuentran en el cuello del tallo del amplio rango de plantas hospedadoras. A veces las agallas se presentan en tallos y en raíces. Estas agallas son unos tumores que se forman por la proliferación anormal de las células de la planta debido a que el fitopatógeno Agrobacterium tumefaciens introduce material genético dentro de la planta que altera y desregula la maquinaria transcripcional de la célula vegetal en beneficio del fitopatógeno. Al proceso de introducción de ADN dentro de una célula vegetal se denomina transformación. En este caso es una bacteria quien lleva a cabo la transformación, en lo que podríamos calificar de primera transferencia de ADN estudiada entre dos reinos diferentes y muy separados entre sí, las bacterias y las plantas. Como siempre, las bacterias están dándonos lecciones sobre diversidad, evolución y adaptación al medio sacando de él todo el provecho posible.

En el proceso de transformación llevado a cabo por Agrobacterium tumefaciens, al ADN que es introducido dentro de la célula vegetal se le denomina ADN de transferencia o T-DNA. Este T-DNA se encuentra originalmente en un plásmido de A. tumefaciens que denominamos plásmido inductor de tumor o plásmido Ti. La mayor parte de las cosas que se conocen relativas al proceso de transformación que lleva a cabo A. tumefaciens están relacionadas en gran medida con la bacteria. De hecho, se han identificado la inmensa mayoría de los genes de la bacteria que intervienen en este complejo proceso, y se han caracterizado bien las proteínas codificadas por dichos genes. Sin embargo, la identificación y caracterización de la función que desempeñan las proteínas de la planta que intervienen en el proceso es bastante escasa por el momento.

Etapas del proceso de transformación

1.- El proceso de transformación de la planta empieza con la existencia en la planta hospedadora de una herida. En la naturaleza, A. tumefaciens comienza su ataque fundamentalmente por los tejidos vegetales heridos ya que a través de ellos la planta secreta un amplio rango de compuestos fenólicos y azúcares que funcionan como atrayentes químicos para la bacteria. A. tumefaciens se ancla a la pared celular de la planta hospedadora mediante una serie de proteínas conocidas. No obstante, todavía no se conoce la identidad de los receptores que deben existir en la superficie vegetal.

2.- A continuación la bacteria reconoce señales que proceden de la célula vegetal (compuestos fenólicos). En este sistema interviene un sistema de transducción de señales de dos componentes. Uno de esos componentes, VirA, recibe la señal en la membrana de la bacteria, y fosforila a VirG, que es la proteína transmisora de la señal.

3.- VirG transmite la señal activando la expresión de los genes de virulencia que están localizados en el plásmido Ti.

4.- Algunas de las proteínas Vir generadas, en concreto VirD1 y VirD2, se encargan de extraer la hebra 5' del fragmento del plásmido Ti que contiene el T-DNA. El T-DNA es un fragmento específico del plásmido Ti de A. tumefaciens que está limitado por dos repeticiones de 25 pb denominadas borde derecho e izquierdo del T-DNA. Esta hebra sencilla de DNA a la que la proteína VirD2 ha quedado unida se denomina complejo T inmaduro.

5.- Transporte del complejo T inmaduro y de algunas de las proteínas Vir al citoplasma de la célula vegetal hospedadora a través de un sistema de secreción de tipo IV que estructuralmente está compuesto por las proteínas VirD4 y VirB.

6.- El complejo T inmaduro es protegido por proteínas VirE2 que lo recubren dando lugar al complejo T maduro.

7.- Dentro del hospedador existen proteínas que reconocen a algunas de las proteínas Vir que han pasado al citoplasma de la célula vegetal, en particular a VirD2 y VirF. Dichas proteínas vegetales interaccionan con el complejo T maduro y colaboran en la translocación del mismo al interior del núcleo de la célula vegetal.

8.- Integración del T-DNA en el genoma de la célula vegetal merced a la acción de proteínas del hospedador que interaccionan con VirD2 y VirE2, las proteínas que protegen al T-DNA.

Una vez insertado el T-DNA en el genoma de la célula hospedadora, empieza a transcribirse y se codifican proteínas de dos tipos: a) Por un lado, las proteínas que van a provocar el crecimiento incontrolado de las células vegetales, con lo que se formará un tumor o agalla de corona. b) Por otro lado, las proteínas implicadas en la síntesis de aminoácidos y derivados de azúcares-fosfato de los que se nutre específicamente el patógeno. De este modo el patógeno se asegura que la mina en que se ha convertido la planta produzca en exclusiva para él y no para otras bacterias que traten de aprovechar la coyuntura. La especificidad de los productos nutritivos generados por la planta, conocidos como opinas, llega al nivel de cepa, por lo que se utilizan tales productos para clasificar las cepas de A. tumefaciens. Además, las opinas generadas por una cierta cepa de A. tumefaciens posibilitan la interacción con una determinada especie vegetal y no con otras. Luego las opinas también son un elemento de reconocimiento por parte de la planta de las bacterias compatibles de A. tumefaciens.

Esta capacidad que tiene A. tumefaciens para introducir ADN externo a la planta ha hecho que la utilicemos como herramienta biotecnológica para la transformación vegetal. Gracias a ella la producción de plantas transgénicas es un proceso sencillo y muy eficiente. Para ello se utiliza el mismo plásmido Ti, donde se han delecionado los genes de virulencia (generación de tumores y síntesis de opinas) y se mantiene la maquinaria de transferencia del DNA. Sólo tenemos que poner entre los bordes del T-DNA el gen que nos interese introducir en la planta y esperar a que la bacteria haga su trabajo. ¿El inconveniente? Que A. tumefaciens no infecta todas las plantas y es especialmente recalcitrante con la monocotiledóneas, el grupo de plantas donde se encuentran las más importantes para la humanidad desde el punto de vista alimenticio.

Burkholderia cepacia

Esta bacteria Gram-negativa pertenece a la familia Burkholderiaceae dentro de la clase beta-Proteobacteria del phylum Proteobacteria. Es la típica bacteria que produce una enfermedad muy conocida en la cebolla. Curiosamente, las cebollas están perfectamente bien por fuera pero se las corta longitudinalmente y se encuentran dos o tres capas intermedias de color amarillo-oscuro/marrón. Las capas interiores y exteriores a las sintomáticas, en cambio, parecen no estar afectadas. Lo más habitual es que la planta se haya contaminado con la bacteria a nivel del cuello por alguna herida o que el agua de riego estuviera contaminada. De ahí que sea tan recomendable regar por surcos, nunca por aspersión porque aumentan mucho las infecciones.

La variabilidad de la especie Burkholderia cepacia es enorme. En ella podemos encontrar desde patógenos de plantas a patógenos de animales y de humanos, pasando por cepas endosimbiontes de hongos fitopatógenos. En este caso B. cepacia ayuda al hongo secretando toxinas que debilitan a la planta y favorecen el ataque del hongo. Otras cepas, por el contrario, son endosimbiontes de hongos endofíticos beneficiosos. Otras son endosimbiontes de insectos fitófagos, en cuyo caso podría ser interesante el uso de B. cepacia como agente de biocontrol. El genoma de B. cepacia es relativamente grande, aproximadamente el doble que el de Escherichia coli. Parece que los genomas grandes corresponden a bacterias capaces de vivir en ambientes donde los recursos son escasos pero variados, como los suelos o las plantas. Esta podría ser una explicación de la gran adaptación a ambientes muy diversos de B. cepacia.

Bacterias de B. cepacia como agentes de biocontrol y estimuladoras del crecimiento en plantas

Estas bacterias abundan de forma natural en el suelo, en el agua, y en la superficie de las plantas. Muchas de ellas tienen capacidad para metabolizar un amplio rango de compuestos orgánicos, razón por la que se las ha utilizado como agentes de biorremediación de suelos y aguas contaminados con organoclorados y otros herbicidas. Hay algunas cepas que fijan nitrógeno. Otras cepas han sido aceptadas por los fitopatólogos como agentes de biocontrol frente a enfermedades que se mantienen en el suelo, las hojas, o enfermedades post-cosecha. Muchas cepas producen uno o más antibióticos activos contra un amplio rango de hongos fitopatógenos, y de este modo contribuyen a la supresión de la enfermedad. Su empleo como agentes de biocontrol permite reducir el empleo de agroquímicos. Algunas cepas ya se comercializan con esta finalidad.

Bacterias de B. cepacia como patógenos de humanos

Además de su papel como agentes de biorremediación y de control biológico, existen algunas cepas que se comportan como patógenos oportunistas en humanos. Éstas son responsables de infecciones hospitalarias y de las infecciones en pulmón en pacientes con fibrosis quística. El tratamiento antibiótico es complicado por los problemas de resitencia a múltiples antibióticos.

Ralstonia solanacearum

Siguiendo con la misma familia, Burkholderiaceae, aquí tenemos otro fitopatógeno hemibiotrofo que puede vivir como saprófito en el suelo hasta que invade las raíces de las plantas susceptibles, coloniza el xilema y migra a las hojas de la planta, donde se acumula y desorganiza el sistema vascular de la planta. Provoca el marchitamiento de cultivos importantes como tomate, patata y banana.

El desarrollo de la enfermedad está ligado a los sistemas de secreción de tipo II y III. La mayor parte de enzimas que degradan la pared celular (celulasa, peptín metilesterasa, celobiosidasa y 3 poligalacturonasas) se secretan por medio del sistema de tipo II. Aparte de éstas que se conocen, se estima que al menos son 30 las proteínas secretadas por este sistema.

La comunicación intercelular es la responsable de la transición del estado inicial de infección al avanzado. En este caso, al contrario de lo que ocurría con P. syringae, los sistemas de dos componentes sólo complementan la regulación global de la virulencia. Ralstonia usa una molécula difusible genuina en la comunicación, el ácido 3-hidroxi palmítico metil éster (3-OH-PAME). El 3-OH-PAME está codificado por el operón phc que codifica PhcB, la sintasa de 3-OH-PAME, y PhcS, el regulador de respuesta. Cuando la densidad celular es baja, o en condiciones no confinadas, PhcA es inhibido por el sistema 3-OH-PAME. Pero cuando la densidad poblacional de la bacteria aumenta, el sistema se desreprime. Entonces PhcA activa los factores de virulencia requeridos para los últimos estado de la infección (síntesis de EPS, celulasas) y reprime los factores de virulencia requeridos en los estados tempranos de la infección (sistema de secreción de tipo III, mobilidad, y síntesis de sideróforos). El sistema 3-OH-PAME también permite la sobreexpresión de un sistema de quorum sensing codificado por SolI/SolR. SolR activa la expresión de al menos un gen, aidA. La función de la proteína AidA se desconoce. SolI/SolR son miembros del regulón del sistema de comunicación dependiente de 3-OH-PAME que controla el paso del modo de vida saprofítico o colonizador temprano a patógeno en estado avanzado de infección.

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